1.概述。在反相液相色譜分析方法開發過程中，采用等度洗脫時，先洗脫組分的色譜峰峰寬較窄，后洗脫組分的色譜峰峰寬較寬；而梯度洗脫方式，則具有分析時間短(特別是對于樣品組分復雜的情況來說)，在梯度范圍內各色譜峰的峰寬近乎一致等特點。梯度洗脫時色譜峰縱向擴展可控特點，可參考下圖1進行理解。
　　
基質或者樣品組分比較復雜時，梯度洗脫是反相液相色譜最常用的操作模式，而主要在梯度洗脫中出現的鬼峰是特別讓人頭疼的。有可能由于來源排查不清以及解決方案不到位而導致原來的方法在實際的應用與轉移過程中出現問題，甚至面臨重新開發方法的尷尬境地。鬼峰意即來源不清，不可指認，時有時無，對目標峰或者樣品純度測試產生干擾作用的峰，如下圖2所示，即為典型的鬼峰，一般來講，鬼峰的出現與色譜柱無關(當然，梯度洗脫時，梯度設置不合適的情況除外)。
　　
對于含量或者純度檢測方法而言，在主峰位置或附近出現鬼峰的話，影響到方法的專屬性以及檢測結果準確性(如下圖3)。特別地，對于藥物制劑或者API的純度測試來說，要求對降解產生的雜質之外的雜質來源做出較詳細的說明(如反應副產物或者反應原料帶入等)。鬼峰的出現，可能增加此項工作的難度與工作量。
　　
此外，鬼峰需要與梯度洗脫時由于梯度的突然變化引起的梯度峰進行區分，如下圖4所示，在20 min處由于梯度的陡然變化，造成流動相組成的急劇改變引起流動相折光特性發生很大的變化，而出現梯度峰(其峰形與所定的檢測波長有關)。
　　
在梯度洗脫模式下，可以通過避免突然大范圍改變流動相的組成來避免尖銳的梯度峰的出現，同時也有助于減少泵的故障率。
　　
2. 鬼峰來源與解決方案。鬼峰來源多種多樣，理論上講，在HPLC系統中任何一個節點均有可能引入鬼峰，依據鬼峰出現的頻率，其主要來源于流動相部分，樣品制備以及自動進樣部分，儀器流路及檢測器部分等，如下圖5所示。
　　
2.1 儀器流路及檢測器引起的鬼峰。儀器流路中的殘留氣泡可以引起鬼峰，保留時間一般不可重現，即使流路中氣泡連續存在，鬼峰出現的位置亦不可預測。可將流動相超聲或鼓He脫除氣泡并打開purge閥，大流速沖出儀器管路中的氣泡，來減少氣泡引起的鬼峰現象。由泵的混合或者泵的突然切換引入的鬼峰一般發生在梯度峰及其之后位置，在低壓混合模式下出現的可能性更大。實際應用中(無論是高壓混合模式還是低壓混合模式)，梯度峰之后經常是不被關注的地方，如下圖6。同一臺儀器，可通過進樣Blank或檢查紫外吸收光譜，確認其是否為鬼峰。在不影響分析方法目的以及對結果判斷的情況下，可不用對此過于糾結。
　　
檢測器處引入的鬼峰，多為一些樣品組分在檢測器流通池內的殘留，其特點具有先后針之間的重復性差，或者沒有重復性，色譜峰峰形特別尖銳類似大的毛刺。該種情形下，需要對流通池特別是石英視窗進行徹底清洗(聯系工程師或者嚴格按照manual進行)。
　　
混合器本身有時也會引入鬼峰，如下圖所示同樣的流動相，在系統流路的不同位置(分別為混合器前面與后面)添加污染物捕集裝置，對基線進行監測如下圖7所示。從圖中可以明確看出混合器由于被污染而在色譜圖上引入了鬼峰。
　　
此外，同一臺儀器經常在不同的流動相體系之間進行切換的時候，特別需要注意整個儀器管路內的污染物殘留。當懷疑儀器流路內壁被殘留物污染時，可用水：乙腈：異丙醇：甲醇=1：1：1：1的比例，以1mL/min的流速沖洗整個流路2h以上，可將流路內的污染物殘留沖洗完全。
　　
2.2 樣品制備以及自動進樣引入的鬼峰。由樣品制備引入的鬼峰，多集中與使用了不干凈被污染的溶劑或者不干凈的進樣小瓶(如下圖8)。
　　
這種情況下的鬼峰，容易排除，僅需要分別將樣品溶解或稀釋用的試劑以及進樣小瓶更換，即可確定鬼峰的來源。
　　
此外，由自動進樣器引入的鬼峰，也不在少數。自動進樣器進樣的流程(如下圖9)所示。在進樣之后，部分樣品溶液殘留在進樣針頭以及針座之上，對下次進樣別的樣品的結果產生干擾，出現鬼峰。對于一些強吸附性組分，盡管進行程序洗針，有時依然可能會引入鬼峰。
　　
針對這種情形，可在儀器平衡之后，分別進樣不同試劑的Blank以及不進樣，比較得到的圖譜，基本可確定鬼峰是否來源于進樣過程。
　　
2.3 流動相引入的鬼峰。在實際的應用中，鬼峰最主要來源為流動相，包括水相，有機相，有機酸堿添加劑，緩沖鹽以及流動相瓶等，(如下圖10)所示。
　　
其中水相引入的鬼峰是最常見的，水中含有的有機，無機雜質均有可能對檢測結果產生干擾，出現鬼峰。水相引入鬼峰的可能原因有：水中本來含有的有機，無機雜質；水相在使用過程中有塵埃或者空氣中的有機物落入或溶解進去；水相在存放或使用的過程中，細菌等微生物滋生等。
　　
有機相如甲醇，乙腈，四氫呋喃等，亦有可能引入鬼峰(如上圖10所示)。有機相引入的鬼峰，原因多為有機相使用完之后未更換新的流動相瓶，而是直接添加補充的方式；以及流動相長期使用過程中從實驗環境中富集來的污染物。
　　
在實際操作中，可以采用下述方法判斷鬼峰來自水相還是有機相。當懷疑鬼峰來自水相的時候，以低比例有機相的流動相(5%或以下的有機相)平衡色譜柱15以及30min，之后以一定的梯度進行洗脫，若發現色譜圖中累積的鬼峰與色譜柱平衡時間直接相關(如下圖11A所示)，基本可判斷鬼峰來源與水相。如果鬼峰的累積量與平衡時間長短之間無直接相關關系，則鬼峰來源與有機相(如下圖11B所示)。
　　
在使用有機酸堿添加劑以及緩沖鹽的時候，鬼峰則可能是由于添加劑以及緩沖鹽引入的(如下圖12)，因此在實際使用時，需要使用HPLC級別的添加劑以及緩沖鹽，并在條件允許的情況下，對比不同廠家選擇最好的。
　　
此外，流動相瓶也是鬼峰來源之一，對于新的流動相瓶在使用之前，需要進行徹底清洗，如先用熱的自來水沖洗10遍之后用去離子水沖洗10遍，在清洗過程中不可使用洗滌劑。
　　
2.4 其他引入的鬼峰。一般地，色譜柱本身不會引入鬼峰，但色譜柱可對流動相或系統流路內的強保留污染組分起到富集作用，在有機相比例隨梯度程序變化的過程中而被沖洗出來。這一點，在使用較長的色譜柱的時候尤其值得關注，因為色譜柱本身較長，在HPLC上其允許的操作流速較小，需要的平衡時間較長。以低比例有機相作為起始流動相進行色譜柱平衡的時候，水相中的強保留污染物被色譜柱富集，之后在梯度運行的時候被洗脫出來，這種鬼峰的出峰位置一定，大小一定。也因此，在水相不確定是否有雜質存在的條件下，梯度運行后的再平衡時間盡可能的短，一般以10倍柱體積為宜。
　　
2.5 如何應對鬼峰。從上面的討論，鬼峰的來源多種多樣，基本應對原則就是，找到鬼峰的來源，更換流動相或更換添加劑或對儀器被污染部分進行清洗。此外，由于大部分的鬼峰來源與流動相以及色譜柱之前部分流路，在液相色譜流路中添加雜質捕集裝置，可消除大部分的鬼峰干擾。而捕集裝置的安裝位置有多處，(如下圖13)所示。
　　
捕集裝置的安裝位置不同，消除鬼峰干擾的效果也不同，如上圖中e處位置的捕集效果要好于d處，但若混合器是干凈的，兩處的效果則是等效的。在泵后使用雜質捕集裝置，系統壓力會隨著污染物在捕集裝置上的積累而逐漸增加，因此需要定期更換。
　　
而對于使用有機酸堿添加劑或者緩沖鹽流動相的含量或放行分析方法，也可以通過改變梯度程序，將鬼峰與主峰的出峰位置最大程度地拉開，避免鬼峰對于樣品組分含量測定結果的影響。
　　
3. 結論。鬼峰對于反相液相色譜來說，是經常遇到的問題，對分析方法造成干擾并影響分析結果的準確性。盡管其來源多種多樣，但可根據鬼峰的特點，追溯其來源并針對來源進行相應地處理(如更換流動相，清洗流路，沖洗色譜柱等)。在排除儀器本身的原因之外，鬼峰主要來源于流動相特別是水相以及添加了添加劑或緩沖鹽的水相，在液相色譜流路中添加雜質捕集裝置，可以最大可能的減少鬼峰的出現，但需要定期更換該裝置。
---本文摘自藥渡，作者微信號：Lindaring001