由于高效液相靈敏度高，對(duì)流動(dòng)相溶劑的純度要求較高，不純的溶劑會(huì)引起基線不穩(wěn)或產(chǎn)生“偽峰”。此外，溶劑的極性也要與待測(cè)樣品、檢測(cè)器匹配等等。如果溶解度欠佳，樣品會(huì)在柱頭沉淀，不但影響純化分離，且會(huì)使柱子惡化。那么，我們?cè)贖PLC溶劑選擇的時(shí)候，需要遵循哪些原則呢？

參考下表常用溶劑在不同波長(zhǎng)下的吸收值：

1、流動(dòng)相溶劑的選擇：流動(dòng)相溶劑的正確選擇對(duì)于高效液相色譜分析(HPLC)的成功與否非常重要。目前還沒(méi)有一個(gè)較為理想的選擇模式，主要依賴(lài)于經(jīng)驗(yàn)的積累。

流動(dòng)相溶劑選擇的一般要求是： (1)溶劑應(yīng)當(dāng)是高純度，溶劑與固定相不互溶，并能保持色譜柱的穩(wěn)定性；(2)溶劑的性能與使用的檢測(cè)器應(yīng)當(dāng)匹配；(3)溶劑對(duì)樣品應(yīng)有足夠的溶解能力；(4)溶劑應(yīng)具有低的粘度和適當(dāng)?shù)偷姆悬c(diǎn)；(5)盡量避免使用具有顯著毒性的溶劑。在選擇流動(dòng)相溶劑時(shí)，可以從影響分離度R 的因素即柱效、分離因子a和容量因子來(lái)考慮。選擇溶劑時(shí)首先應(yīng)排除一些物理性質(zhì)(如沸點(diǎn)、粘度、紫外吸收等)不適于在液相色譜中使用的溶劑，然后選擇能使分析樣品中組分的容量因子值保持在1～1O之間、洗脫強(qiáng)度適當(dāng)?shù)娜軇?duì)含多組分的樣品、值可擴(kuò)展在0.5～20之間。在選出適用值的溶劑當(dāng)中，還要進(jìn)一步選擇能將樣品中的不同組分分離開(kāi)、且能使每個(gè)相鄰組分的分離因子a大于1.05的溶劑。所選擇的適用Ic，和a的溶劑還必須與能提供高理論塔板數(shù)的色譜柱相組合。因此，作為一個(gè)色譜工作者，熟悉表征溶劑物理和化學(xué)特性的重要參數(shù)，如溶劑強(qiáng)度參數(shù)￡、溶解度參數(shù)δ、極性參數(shù)P、粘度η等，對(duì)液相色譜法流動(dòng)相溶劑的選擇會(huì)起到十分重要的作用。
 
能夠作為液相色譜流動(dòng)相使用的溶劑有100多種，但實(shí)用的溶劑只有少數(shù)幾種。在實(shí)驗(yàn)室中有了甲醇、乙腈、水、四氫呋喃、正己烷、二氯甲烷，就能夠解決9O％以上的色譜分離問(wèn)題。

 2、溶劑的處理和更換：液相色譜溶劑應(yīng)盡量使用HPLC級(jí)溶劑。HPLC級(jí)試劑是用特殊方法生產(chǎn)的含有最少的微粒和最低的紫外吸收物質(zhì)。水也應(yīng)達(dá)到HPLC級(jí)。液相色譜實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配有純水發(fā)生器。非色譜純?nèi)軇┛赏ㄟ^(guò)蒸餾方法進(jìn)行提純，除掉大部分有紫外吸收的雜質(zhì)。另外，用氧化鋁或硅膠柱可除去極性強(qiáng)的化合物。

理論上，完全由HPLC級(jí)溶劑組成的流動(dòng)相不必過(guò)濾（但因操作過(guò)程中，因溶劑本身，容器、環(huán)境等原因，建議在進(jìn)入系統(tǒng)使用前使用相應(yīng)的濾膜進(jìn)行過(guò)濾操作），其他溶劑由于含有不溶性微小顆粒，會(huì)逐漸堆積在色譜柱中堵塞流動(dòng)相的通道，使柱壓力升高，柱效率下降，因此使用前一定要用0.2～0.5um 的過(guò)濾器過(guò)濾。當(dāng)使用固體化學(xué)試劑(如緩沖鹽)配制流動(dòng)相時(shí)過(guò)濾特別重要，不能讓固體微粒污染泵的單向閥、阻塞、損壞進(jìn)樣器和柱頭過(guò)濾片。現(xiàn)有過(guò)濾器有水溶性和脂溶性?xún)煞N過(guò)濾膜供選擇。過(guò)濾水溶性流動(dòng)相時(shí)(如甲醇／水)，先用1～2 mL甲醇潤(rùn)濕過(guò)濾膜，有助于快速抽濾。

流動(dòng)相在使用前必須進(jìn)行脫氣處理(連同貯液器一起脫氣效果更好)， 以除去其中溶解的氣體，防止在洗脫過(guò)程中當(dāng)流動(dòng)相由色譜柱流至檢測(cè)器時(shí)，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡。若在死體積檢測(cè)池中，存在氣泡會(huì)增加基線噪聲，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造 成分析靈敏度下降。流動(dòng)相中的氧氣對(duì)光電檢測(cè)器影響最大，使紫外檢測(cè)器基線增高，低波長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)信號(hào)被抵消掉。在熒光檢測(cè)中O2會(huì)使樣品的熒光淬滅，降低靈敏度，還會(huì)導(dǎo)致某些組分被氧化或使柱中固定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。常用的脫氣方法有① 氦脫氣；② 加熱回流；③ 真空脫氣；④ 超聲波脫氣。從脫氣速度和效果看，加熱回流法最好，但操作不方便，存在著火的危險(xiǎn)。對(duì)于混合流動(dòng)相不提倡用此法，因?yàn)閾]發(fā)性組分會(huì)損失掉，改變流動(dòng)相的組成。超聲脫氣法只能除去3O 的溶解氣體效果最差。近年來(lái)新出現(xiàn)的在線真空脫氣法(on—line degasser)，把真空脫氣裝置串接到貯液系統(tǒng)中，并結(jié)合膜過(guò)濾器，實(shí)現(xiàn)了流動(dòng)相在進(jìn)人輸液泵前的連續(xù)脫氣。其脫氣效果明顯優(yōu)于上述4種方法，并適用于多元溶劑體系。

在HPLC中需要經(jīng)常更換新溶劑。更換溶劑時(shí)，必須將原有的溶劑沖洗干凈。如果新舊溶劑是互溶的，則必須保證新溶劑使色譜柱重新達(dá)到平衡。否則將產(chǎn)生基線漂移。若新舊溶劑不互溶，則要選擇與原溶劑和新溶劑(正相和反相)都相溶的過(guò)渡溶劑沖洗，然后再用新溶劑沖洗。如異丙醇是1種很理想的過(guò)渡溶劑。特別要注意防止新舊溶劑發(fā)生反應(yīng)或生成沉淀物，否則將給管路、泵及檢測(cè)器帶來(lái)污染和堵塞，給清洗工作帶來(lái)麻煩。

如果緩沖液反相流動(dòng)相被正相流動(dòng)相所污染，產(chǎn)生緩沖鹽沉淀，可用5倍柱體積的非緩沖液反相流動(dòng)相沖洗系統(tǒng)，再用10倍柱體積的強(qiáng)溶劑(如乙腈)通過(guò)系統(tǒng)，最后用50倍柱體積的異丙醇沖洗系統(tǒng)，以除去所有滯留的流動(dòng)相和溶劑殘留，換上反相流動(dòng)相沖洗，使系統(tǒng)重新平衡。如果正相流動(dòng)相被水溶性溶劑所污染，先用50倍柱體積的異丙醇沖洗，而后用正相流動(dòng)相沖洗。在分析樣品前，最少需用10倍體積的最終流動(dòng)相沖洗系統(tǒng)。

3、溶劑與檢測(cè)器的匹配：在使用紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器時(shí)，需選用無(wú)紫外吸收特性的溶劑作流動(dòng)相。樣品測(cè)定波長(zhǎng)應(yīng)當(dāng)在溶劑紫外吸收波長(zhǎng)上限以上，噪聲降至10-4 ～ 10-5AU，才能保證檢測(cè)的靈敏度，才能用于梯度洗脫。流動(dòng)相溶劑在整個(gè)梯度范圍內(nèi)互溶性要好，盡量減少溶劑折光指數(shù)對(duì)溶劑組成梯度的影響。溶劑折光指數(shù)的改變會(huì)導(dǎo)致紫外吸收度的變化，使紫外檢測(cè)器產(chǎn)生噪音和漂移。因此，當(dāng)使用兩種或兩種以上溶劑做梯度時(shí)，其折光指數(shù)應(yīng)該盡量接近，盡量減少溶劑紫外吸收度改變的影響。
 

在使用示差折光檢測(cè)器時(shí)，應(yīng)使流動(dòng)相的折光指數(shù)與被測(cè)樣品的折光指數(shù)有盡可能大的差別，因?yàn)槎叩恼凵渎什顒e越大，檢測(cè)器的響應(yīng)信號(hào)越大，檢測(cè)靈敏度越高。示差折光檢測(cè)器一般不用于梯度洗脫，這是因?yàn)殡S溶劑組成的改變，流動(dòng)相的折光指數(shù)也在改變，無(wú)法使基線穩(wěn)定。

使用熒光檢測(cè)器時(shí)，不能使用可熄滅、抑制或吸收熒光的溶劑作流動(dòng)相。溶劑的極性和溶液的溫度對(duì)熒光強(qiáng)度有明顯的影響。增大溶劑的極性，導(dǎo)致熒光增強(qiáng)。通常熒 光物質(zhì)溶液的熒光效率和熒光強(qiáng)隨著溫度的升高而降低。此外，當(dāng)樣品濃度較高時(shí)，易引起熒光猝滅效應(yīng)和內(nèi)濾效應(yīng)，溶液濃度越大，該效應(yīng)越顯著，溶液中的其它 成分，特別是順磁性物質(zhì)的存在，將使猝滅效應(yīng)加劇。因此，在進(jìn)行熒光檢測(cè)時(shí)，試樣要配成低于10-6 g／mL濃度的溶液，要使用不含熒光物質(zhì)的溶劑。

電化學(xué)檢測(cè)器所用的流動(dòng)相必須具有導(dǎo)電性。安培檢測(cè)器采用的流動(dòng)相中必須有常用濃度范圍為0.01 mol／L-0.1 mol／L電解質(zhì)(如含鹽的緩沖液)存在。流動(dòng)相要有足夠高的介電常數(shù)，使電解質(zhì)充分解離。流動(dòng)相在電極表面呈電化學(xué)惰性，工作電壓下背景電流小。

為什么乙醇、丙醇、丙酮不被用做流動(dòng)相？研究表明，當(dāng)流動(dòng)相的A>0.7的時(shí)候，基線噪聲會(huì)顯著增加，一般選擇的吸收值<0.5。當(dāng)A>1.0時(shí)，基本就不能用使了。對(duì)于示差折光檢測(cè)器，主要考慮樣品和流動(dòng)相的折光率，選用的溶劑粘度要低、沸點(diǎn)適中使用低粘度溶劑，可減小容質(zhì)的傳質(zhì)阻力，降低柱壓，利于提高柱效。從分離制備和色質(zhì)連用考慮，沸點(diǎn)要適中，低沸點(diǎn)的溶劑有它的優(yōu)點(diǎn);但僅僅用 于分析，沸點(diǎn)太低，反而由于溶劑的揮發(fā)，造成保留時(shí)間的變化。盡量不用高毒性的溶劑不只是環(huán)境，單從我們自身的安全考慮，當(dāng)然用低毒溶劑最好。溶劑對(duì)樣品有足夠的溶解力樣品如果不能溶解在選用的溶劑里，還怎么分析? 但如果樣品在流動(dòng)相里溶劑仍然不大，可以用樣品的最佳溶劑先溶解，再用流動(dòng)相稀釋?zhuān)涂梢粤恕Ｖ懒松厦孢x擇溶劑的一般原則，就不難理解為什么不同乙醇、丙醇做流動(dòng)相的原因了，因 為它們的粘度大。 還有丙酮，雖然粘度和毒性較低、溶解度大、極性適中，但用于它的截至吸收波長(zhǎng)為330nm， 所以不常用，如果樣品的吸收大于330nm，其實(shí)用丙酮是一個(gè)不錯(cuò)的選擇。
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